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柴胡属5种易混药材的鉴别研究

日期: 2017-05-02
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柴胡始载于《神农本草经》,原名茈胡,列为上品,至《本草图经》始易其名为柴胡,距今已有2000多年的应用历史,临床上常用于治疗感冒发热、寒热往来、胸胁胀痛等症状[1, 2]。柴胡的药用价值及疗效决定了其应用范围的广泛性,成为中药材市场中的主要流通品种之一。

 

2015年版《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)规定柴胡为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC. 或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd. 的干燥根,分别习称为“北柴胡”和“南柴胡”[3]。然而,近年来柴胡属的大多数植物均在实际应用中作药用,使用品种混乱,其质量也是连年下降。

 

柴胡属药材的使用在我国大概可分为3类:北柴胡类、红柴胡类和竹叶柴胡类[4]。

北柴胡常见的混淆品种有银州柴胡Bupleurum yinchowense Shan et Y. Li、小叶黑柴胡Bupleurum smithii var. parvifolium Shan et Y. Li、锥叶柴胡Bupleurum bicaule Helm等;

南柴胡、锥叶柴胡等又可称为“红柴胡”,南柴胡现在的产量很少,市场上流通的多为锥叶柴胡(市场上称为“海拉尔柴胡”);

竹叶柴胡类多分布在西南地区,常作药用的主要有膜缘柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. 及其变种窄竹叶柴胡Bupleurum marginatum Wall. ex DC. var. stenophyllum (Wolff) Shan et Li. [5]。

 

柴胡属植物的化学成分十分复杂,迄今为止已报道含有柴胡皂苷、挥发油、黄酮、甾醇、多糖等多种成分。皂苷是柴胡属植物中的主要化学成分,也是发挥药效的重要部分,主要包括柴胡皂苷-a、-c 和-d[6, 7]。不同的柴胡品种其有效成分含量相差悬殊,如果混用势必会导致临床药效不稳定,因此,有必要对柴胡属的易混药材品种进行鉴别研究。

 

性状、显微、理化等方法多用于易混淆药材品种的鉴别,具有操作简单、经济环保的优点[8-10]。然而,来源为同属的中药材及饮片,性状较为相似,这给传统鉴定带来了不小的困扰,DNA 条形码是利用基因组中一段公认标准的DNA片段鉴定物种的新技术[11],鉴定方法快速、准确,鉴定结果不受植物的生长发育阶段和性状特征等因素的影响,可作为传统鉴定方法的科学佐证。

 

本研究收集到柴胡属北柴胡、南柴胡、竹叶柴胡、藏柴胡及锥叶柴胡共5种易混药材,其中北柴胡有野生和家种之分,结合形态特征及薄层色谱方法对这5种药材进行了鉴别研究,并采用ITS2片段的DNA分子鉴定方法进行基因序列的测定,为柴胡属5种药材的鉴别提供了科学依据。

 

1.实验样品及试剂(略)——详情请见文献

2.实验方法(略)——详情请见文献

 

3.实验结果

3.1药材性状鉴别

3.1.1北柴胡

野生北柴胡呈圆柱形或长圆锥形。长6~15 cm,直径0.2~1.2 cm,根头部膨大,顶端残留2至数十个茎残基,有时可见少数短纤维状叶基,下部多有分枝。表面棕褐色或灰棕色,有纵皱纹、皮孔及支根痕。质硬而韧,不易折断,断面显片状纤维性,形成层呈多个同心环排列,皮部薄,浅棕色,木部黄白色。气微香,无败油气,味微苦辛。见图1A,图2A。

家种栽培北柴胡与野生北柴胡的区别主要在于形状上较为顺直,根头部膨大的不明显,分枝较少,表面颜色较浅,断面形成层环状排列不明显。见图1B,图2B。

3.1.2南柴胡

根呈长圆锥形,较细。长5~12 cm,直径0.2~0.5 cm,近根头部有多数细而紧密的环纹,根头顶部密被纤维状叶基残余和1~3个茎残基,下部极少分枝。表面棕红色或棕褐色,具纵皱纹及皮孔。质稍软而脆,易折断,断面略平坦,不显纤维性。略具败油气,味微苦辛。见图1C,图2C。

3.1.3竹叶柴胡

根多呈纺锤状,细长,下端常成扭曲状。顶端残留数个茎基和叶基,茎基部有密集的节,根头部有时可见密集的环纹,稀分枝。表面黄棕色或棕褐色,有纵皱纹,皮孔明显。质坚韧,不易折断,折断面显纤维性。气清香,味微苦辛。见图1D,图2D。

3.1.4藏柴胡

根细长圆锥形,弯曲。长达18 cm,直径0.1~0.6 cm,近根头部残留1~3个茎基,茎基部有密集的节,有时下部有分枝。表面灰褐色或黄棕色,具细皱缩,可见皮孔及支根痕。质柔韧,不易折断,断面略显纤维性,皮部较厚呈黑棕色环。气浓郁,久嚼微具辛辣味,有刺喉感。见图1E,图2E。

3.1.5锥叶柴胡

根呈长圆锥形,较直。根头部膨大,残留多数粗细不一的茎基和棕黑色毛刷状纤维,根上部较粗,近根头部处常有鼓起,下部多不分枝或稍分枝。表面黑褐色或略带红棕色,皮孔大,凸出,横向排列。质硬脆,易折断,断面平坦,不显纤维性,栓皮层易剥落,皮部淡棕色,木部黄白色,多见放射状纹理呈“菊花心”样。略具败油气,味微甜略有胡萝卜味。见图1F,图2F。

柴胡属5种易混药材的鉴别研究

柴胡属5种易混药材的鉴别研究

 

3.1.6 柴胡属5种药材性状简易检索表

为便于以上5种药材的鉴别,作者根据药材性状特征编制了检索表。见表2。

柴胡属5种易混药材的鉴别研究

 

3.2薄层色谱鉴别

从薄层色谱图可以看出,不同种柴胡均含有柴胡皂苷d。其中锥叶柴胡(S20~S22)和其他几种差别较大,在Rf=0.9的位置上有一个明显的绿色斑点,其他几种均没有。8个批次的市售柴胡(饮片),各批次间斑点数量、Rf值及颜色较为接近,和2批山西家种北柴胡(S4~S5)也较为一致,仅少数斑点所表现出的含量有所差别。野生北柴胡(S1~S3)和南柴胡(S14)斑点颜色比家种的浅一些,和对照药材较为一致。竹叶柴胡(S15~S16)和藏柴胡(S17~S19)在斑点数量、Rf值和颜色上均与北柴胡没有大的差别,说明这两种在成分类群组成上和《中国药典》收载的正品柴胡比较接近。

柴胡属5种易混药材的鉴别研究

 

3.3DNA条形码鉴别

建树法是DNA条形码鉴别方法中较为直观地反映物种水平分辨效果的方法,能有效地为不同类群物种鉴定提供依据。如图4所示,从构建的NJ系统发育树可知,本研究中22个样本的ITS2序列分别与GenBank序列聚为一支,该鉴定结果与性状鉴别结果相吻合,从侧面验证了本研究中药材基原鉴定的准确性。另一方面,5个柴胡属物种分别各自聚为一支,表现出良好的单系性。因此ITS2序列可用于这5种柴胡药材的物种鉴定。

柴胡属5种易混药材的鉴别研究

 

4.小结与结论

柴胡是比较复杂的品种,除了柴胡属不同品种药材性状较为接近难以准确区分外,因资源量的影响及地区习用情况的不同,市场上出现的品种也很多,这对临床使用的稳定性造成了影响,甚至以前出现过有毒的大叶柴胡Bupleurum longiradiatum Turcz.也做柴胡用的情况,因此对各个品种做到准确鉴别至关重要。本研究收集了《中国药典》中收载的北柴胡和南柴胡以及地方习用品种竹叶柴胡、藏柴胡和锥叶柴胡,通过性状、薄层色谱及DNA条形码的方法对上述各品种进行了鉴别研究。

 

从药材性状上分析,北柴胡(家种和野生品)质较硬,根头部无或少有毛状叶残基;南柴胡和锥叶柴胡根头部均有多数毛状叶残基,断面不显纤维性,具败油气,其中南柴胡近根头部有多数细而紧密的环纹,表面棕红色或棕褐色,味微苦辛,锥叶柴胡表面黑褐色或略带红棕色,栓皮层易剥落,断面多见放射状纹理呈“菊花心”样,味微甜有胡萝卜味;竹叶柴胡藏柴胡表面颜色较浅,茎基部有密集的节,质坚韧,不易折断,断面略显纤维性,其中竹叶柴胡气清香,味微苦辛,藏柴胡皮部较厚呈黑棕色环,气浓郁,久嚼微具辛辣味,有刺喉感。因此从性状特征上可以把这5个品种予以鉴别区分。

 

从薄层色谱图上可以明显看到,锥叶柴胡和其他几种差别较大,在Rf=0.9的位置上有一个明显的绿色斑点,其他几种均没有,因此,本研究建立的薄层方法能够快速、准确地把锥叶柴胡与其他几个品种区别开。竹叶柴胡和藏柴胡在斑点的数量、Rf值及颜色上均与正品柴胡没有大的差别,本实验的薄层方法无法把此两种柴胡与药典品柴胡准确区别开。

 

中药材DNA条形码鉴定系统(BLAST)的ITS2序列比对结果表明,ITS2序列可以准确区分柴胡属这5个物种。基于ITS2序列构建的NJ系统发育树表明,北柴胡、南柴胡、竹叶柴胡、藏柴胡及锥叶柴胡均可各自聚为一支,5种柴胡可以明显区分。传统鉴定与分子鉴定相结合用于中药材及饮片的鉴定是比较富有潜力的新方法,DNA条形码技术为药材基原鉴定提供了一种辅助手段,是传统鉴别方法的有效补充[13]。

 

综上所述,5种药材从性状特征上能够准确予以区分;薄层色谱结果显示,锥叶柴胡和其他几种柴胡区别较大,能够快速鉴别,竹叶柴胡及藏柴胡与正品柴胡较为一致;分子鉴定结果表明ITS2序列可用于5种柴胡药材的物种鉴定,且快速、准确。

 

有学者[14]研究竹叶柴胡,认为单从药效成分测定结果来看,竹叶柴胡完全符合《中国药典》的法定要求。在2010年版《四川省中药材标准》[15]中收载了竹叶柴胡,用药部位为全草,目前,四川、云南等西南地区除使用《中国药典》规定的两个品种外,还习用竹叶柴胡及其变种藏柴胡等入药,且《滇南本草》[16]中收载有柴胡,据图和文字描述,与竹叶柴胡和藏柴胡的基原一致。柴胡资源日益减少,南柴胡在市场上已经很难见到量大的货,地区习用品种竹叶柴胡和藏柴胡使用历史悠久,资源量比较丰富,化学成分类群和正品柴胡也很一致,是否能把这两者作为《中国药典》中柴胡的补充品种,需要我们在药效学方面做更多系统的对比研究,以便合理地进行评价,为临床应用提供科学依据。

 

 

文献来源:《中药材》杂志,《柴胡属5种易混药材的鉴别研究》

作者:丁锤, 徐莹, 马孝熙, 王志鹏, 毛雯雯, 张兰兰

 

参考文献

[1] Yao RY, Zou YF, Chen XF. Traditional Use, Pharmacology, Toxicology, and Quality Control of Species in Genus Bupleurum L.[J]. Chinese Herbal Medicines, 2013, 5(4): 245-255.

[2] Li DQ, Wu J, Liu LY, et al. Cytotoxic triterpenoid glycosides (saikosaponins) from the roots of Bupleurum chinense[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2015, 25(18): 3887-3892.

[3] 中华人民共和国卫生部药典委员会. 中国药典(1部)[M]. 北京: 人民卫生出版社, 2015: 280.

[4] 徐国钧, 徐珞珊. 常用中药材品种整理和质量研究(南方协作组第三册)[M]. 福建: 福建科学技术出版社, 1999: 1-42.

[5] Huang HQ, Zhang X, Xu ZX, et al. Fast determination of saikosaponins in Bupleurum by rapid resolution liquid chromatography with evaporative light scattering detection[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2009, 49(4): 1048-1055.

[6] 杨光义, 叶方, 杜士明. 北柴胡研究概述[J]. 中国药师, 2011, 14(10): 1523-1526.

[7] Tian RT, Xie PS, Liu HP. Evaluation of traditional Chinese herbal medicine: Chaihu (Bupleuri Radix) by both high-performance liquid chromatographic and high-performance thin-layer chromatographic fingerprint and chemometric analysis[J]. Journal of Chromatography A, 2009, 1216(11): 2150-2155.

[8] Zhao ZZ, Liang ZT, Guo P. Macroscopic identification of Chinese medicinal materials: Traditional experiences and modern understanding[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 134(3): 556-564.

[9] 胡双丰. 柴胡与其混淆品小叶黑柴胡及锥叶柴胡的鉴别[J]. 药学实践杂志, 2006, 24(4): 222-225.

[10] 严华, 董亚娟, 程显隆, 等. 南柴胡与常见混伪品的鉴别方法研究[J]. 中国药学杂志, 2015, 50(2): 109-114.

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[12] Tamura K, Stecher G, Peterson D, et al. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0[J]. Molecular biology and evolution, 2013, 30(12): 2725-2729.

[13] 陈士林. 中国药典中药材DNA条形码标准序列[M]. 北京: 科学出版社, 2015: 3-14

[14] 李旻, 王砚, 余弦, 等. 竹叶柴胡根中皂苷类成分的薄层鉴别及含量测定[J]. 中国实验方剂学杂志, 2014, 20(4): 74-77.

[15] 四川省食品药品监督管理局.四川省中药材标准[S]. 四川科学技术出版社, 2010, 250-253.

[16] 兰茂. 滇南本草 (1卷) [S]. 云南人民出版社, 1959: 67.

 

 

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